|
|
Главная \ Методичні вказівки \ Основи біохімічних досліджень та комп’ютерні методи
Основи біохімічних досліджень та комп’ютерні методи« Назад
Основи біохімічних досліджень та комп’ютерні методи 04.02.2015 07:13
Методичні рекомендації до лабораторних робіт
Лабораторна робота № 1 Тема ВИДІЛЕННЯ КАЗЕЇНОГЕНУ. ДОСЛІДЖЕННЯ ФІЗИКО-ХІМІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ КАЗЕЇНОГЕНУ
Молоко має велику поживну цінність, містить майже всі речовини, необхідні для харчування. Білки молока представлені альбуміном, глобуліном, α-, β-, γ- та κ-фракціями казеїногену. Казеїноген – складний білок-фосфопротеїд з молекулярною масою 19–100 кДа. κ-Казеїн відрізняється тим, що містить вуглевод – сіалову кислоту. У молоці молекули казеїну утворюють скупчення (міцели); вони круглястої форми, їх діаметр складає у середньому близько 100 мілімікрон. Вважається, що у кожній субодиниці містяться всі чотири види казеїну. До складу фосфопротеїдів входить фосфорна кислота, сполучена етерним зв’язком з оксіамінокислотами серином та треонином. Фосфопротеїди випадають в осад при підкислення розчину, у воді нерозчинні, але розчиня-ються у розбавлених лугах. У молоці казеїноген знаходиться у формі розчинної кальцієвої солі. Залишки фосфорної кислоти у молекулі казеїногену зв’зані з залишками серіну. Під впливом ферментів травлення (пепсину, химозину) казеїноген перетворюється в казеїн, кальцієва сіль якого нерозчинна у воді. Агрегацію α-, β- і γ-казеїнів можна викликати додаванням іонів кальцію, однак κ-казеїн відіграє роль захисного колоїду, який запобігає спонтанної агрегації міцел казеїну, що надало б молоку консистенцію сиру. При виготовленні сиру до молока для згортання казеїнів додають фермент ренін. Цей фермент відщеплює від κ-казеїну пептид, який містить сіалову кислоту, що порушує стійкість структури міцел казеїну і викликає створоження молока. Відокре-мивши водну фазу (сироватку), масу використовують для виготовлення сиру. Принцип методу. При підкисленні середовища до рН 4.7 (ізоелектрична точка казеїногену) білок випадає в осад. Додавання надлишку кислоти призводить до перезарядження білкових молекул і переходу їх у розчин. Казеїноген висолюється нейтральними солями (хлоридом натрію, сульфатом амонію та ін.). Обладнання: колби; хімічні лійки;фільтрувальний папір; піпетки на 1 та 2 мл; скляна паличка; паперові фільтри; ступка з товкачиком. Матеріали та реактиви: 30 мл знежиреного молока; 10%-ий розчин оцтової кислоти; 0,1%-ий розчин карбонату натрію; 96%-ий розчин етанолу. Хід роботи 1. 30 мл знезжиреного молока розвести чотирьохкратним об’ємом дистильованої води у склянці на 200 мл. 2. При постійному перемішуванні додати по краплям 10%-ий розчин оцтової кислоти до того моменту, поки припиниться виділення осаду казеїно-гену (приблизно 10 мл). УВАГА! Необхідно запобігати надлишку кислоти, оскільки відбудеться розчинення казеїногену! 3. Казеїноген фільтрують через простий паперовий фільтр. 4. Осад промити 2–3 мл дистильованої води. 5. Осад перенести до колби за допомогою скляної лопатки та розчинити у 5 мл 0,1%-го розчину карбонату натрію для видалення жиру. 6. Суміш фільтрують через вологий складчастий паперовий фільтр (жири залишаються на папері). 7. Фільтрат, що містить казеїнат кальцію, знов осаджують 10%-им розчином оцтової кислоти. 8. Осад фільтрують через простий паперовий фільтр. 9. Отриманий осад віджимають між аркушами фільтрувального паперу. 10. Осад розтирають для зневоднення у ступці з 96%-им розчином ета-нолу (спирт додають до одержання консистенції густої сметани). 11. Осад висушити між аркушами фільтрувального паперу.
Характерними фізико-хімічними властивостями білків є висока в’язкість розчинів, незначна дифузія, здатність до набухання у широких межах, оптична активність, рухливість у електричному полі, низький осмотичний і високий онкотичний тиск, здатність до поглинання ультрафіолетових променів (λ= 280 нм). Під впливом різних фізичних та хімічних чинників білки піддаються згортанню та випадають в осад, втрачаючи нативні властивості. Таким чином, наслідком денатурації є втрата характерних для білкової молекули властивостей (розчинність, електрофоретична рухливість, біологічна активність та ін.). Більшість білків денатурує при нагріванні їх розчинів при температурі 50–60 0С. Зовнішні прояви денатурації зводяться до втрати розчинності, особливо в ізоелектричній точці, збільшенню в’язкості білкових розчинів, кількості вільних функціональних SH-груп. Найбільш характерною ознакою денатурації є зменшення або повна втрата білком його біологічної активності.
Визначення ізоелектричної точки казеїногену В ізоелектричній точці (pI) сумарний заряд білків дорівнює нулю, тому білки не рухаються в електричному полі. Ізоелектрична точка є характерною константною величиною для білків. Ізоелектрична точка більшості тваринних білків знаходиться у межах від 5,5 до 7,0, що свідчить про часткове переважання кислих амінокислот. Але в природі є білки, у яких значення pI лежать у крайніх значеннях рН середовища (pI пепсину дорівнює 1, сальміну–12). Значення pI залежить від присутності іонів солей; в той же час на його значення не впливає концентрація білку. Принцип методу. В ізоелектричній точці білки найменш стійкі у розчині та легко випадають в осад. Обладнання: хімічні пробірки; піпетка на 2 мл; мікропіпетка на 0,2 мл; очна піпетка. Матеріали та реактиви: 0,2 М розчин оцтової кислоти; 0,4%-ий розчин казеїногену у 0,2 М розчині ацетату натрію. Хід роботи
Таблиця 2 Приготування розчинів для визначення рІ казеїногену
2. До семи пробірок внести реактиви згідно таблиці у послідовності: розчин оцтової кислоти→ вода→ розчин казеїногену.
3. У пробірках з’явиться помутніння. Зафіксувати ступінь мутності у відповідній колонці таблиці (“+” – слабке помутніння, “++” – середнє, “+++” – сильне). Найбільша кількість осаду буде у тій пробірці, рН якої відповідає ізоелектричній точці казеїногену.
Осадження казеїногену алкалоїдними реактивами
Принцип методу. При додаванні до білкового розчину так званих алкалоїдних реактивів (пікринової кислоти, таніну, залізосиньородистого калію тощо) білки випадають в осад. Реакція зумовлена наявністю у молекулі білку азотистих гетероциклів, аналогічних таким у молекулах алкалоїдів (пірольні, індольні, імідазольні та ін.). Слабке підкислення розчином оцтової кислоти сприяє появі позитивного заряду на молекулі білку та полегшує взаємодію з негативно зарядженими іонами осаджувача. Сильні мінеральні кислоти, які використовують для проведення гідролізу білку, пригнічують дисоціацію органічних кислот та запобігають осадженню білку алкалоїдами. Обладнання: хімічні пробірки; очна піпетка. Матеріали та реактиви: 0,4%-ий розчин казеїногену; 10%-ий розчин оцтової кислоти; 5%-ий розчин залізосиньородистого калію. Хід роботи 1. До пробірки вносять 0,5 мл 0,4%-го розчину казеїногену. 2. Додають 0,1 мл 10%-го розчину оцтової кислоти та шість крапель 5%-го розчину залізосиньородистого калію. 3. Фіксують наявність осаду.
Лабораторна робота № 3 ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ АЛЬФА-АМІЛАЗИ У СИРОВАТЦІ КРОВІ
α-Амілаза (діастаза, α-1,4-глюкан-4-глюканогідролаза; КФ 3.2.1.1) – фермент, який здійснює гідролітичне розщеплення полісахаридів (крохмалю, глікогену, амілози та інших продуктів, що містять три і більше залишків глюкози) до декстринів і мальтози. Процес розкладу полісахаридів, що відбувається за місцем α-1,4-глюкозидних зв’язків, відбувається за декілька етапів: крохмаль → еритродекстрини → ахродекстрини → альтотетроза → мальтоза → глюкоза. Найбільш багаті цим ферментом підшлункова і слинні залози. α-Амілаза секретується у кров головним чином з цих органів, хоча високу амілолітичну активність проявляють також фалопієві труби, кишечник, печінка, нирки, легені, жирова тканина. Вважається, що рівень α-амілази у крові насамперед залежить від функціонального стану печінки. Плазма крові людини містить α-амілазу двох ізоензимних типів: панкреатичну (Р) і слинну (S). У кожному з цих типів амілаз існує декілька ізоформ. Так, показано існування 7 фенотипів амілази слини та 3 фенотипів амілази панкреатичного соку. Изоамілази слини поділяють на дві родини, окремі представники яких відрізняються молекулярною масою та електрофоретичною рухомістю. Амілолітичну активність плазми (сироватки) крові практично здорових людей складають дві ізоамілази Р-типу і три S-типу. Третій тип α-амілази – макроамілаза – утворює комплекс з імуноглобулінами і тому не проходить крізь нирковий фільтр, що зумовлює в окремих випадках постійно підвищену ферментативну активність сироватки (плазми) крові. Із сечею виділяється головним чином Р-амілаза і це зумовлює більшу інформативність визначення активності α-амілази у сечі як тест оцінки функціонального стану підшлункової залози. Вважається, що 65 % амілолітичної активності сироватки забезпечується амілазою слинних залоз. Цим пояснюється та обставина, що при гострому панкреатиті саме Р-амілаза збільшує свою активність у сироватці крові (до 89 %) і особливо у сечі (92 %) без змін показників активності амілази слинних залоз у цих біологічних рідинах. У практично здорових людей вміст слинної та панкреатичної амілази приблизно однаковий, у сечі рівень панкреатичної амілази у 2 рази вище. Фермент зв’язаний як з білкуми плазми крові, так і з форменими її елементами. Можливо, це є формою депонування і транспорту ензима. Методи визначення активності α-амілази у біологічних рідинах (сироватці, сечі, поті) поділяють на дві основні групи: 1) цукрофікуючі, засновані на дослідженні цукрів, що утворюються з крохмалю, за редукуючою дією глюкози і мальтози. В останній час одержали розповсюдження цукрогенні методи визначення активності α-амілази, засновані на ферментативному визначенні продукту реакції – глюкози. 2) амілокластичні, що базуються на визначенні залишку нерозщепле-ного крохмалю за ступенем інтенсивності його реакції з йодом. За думкою багатьох авторів, амілокластичні методи – більш специфічні та чутливі, ніж цукрофікуючі. З них найбільш зручними для практичної ро-боти є мікрометоди Сміта і Рое у модифікації Каравея (зі стійким субстратом) і деяких інших авторів. Для оцінки об’єму розщеплення крохмального субст-рату використовують турбідиметричний, йодометричний або нефелометричний засоби його визначення. Йодометричні методи засновані на здатності надлишку негідролізованого субстрату давати з йодом забарвлені сполуки. Активність ферменту визначають за зменшенням оптичної густини розчину субстрату після його гідролізу α-амілазою. Залежність забарвлення від властивостей і складу крохмального субстрату ускладнює вирішення проблеми уніфікації методів визначення активності α-амілази. Йодометричні методи на сьогодняшній день не втратили свого значення; їх позитивні якості – доступність реактивів, використання простого оптичного обладнання. α-Амілаза сироватки крові стабільна протягом 1 тижня при кімнатній температурі (18-25о С), 2 місяця – при температурі 2–8о С). Фермент сечі стабільний протягом 2 діб при кімнатній температурі та 10 діб – при температурі 2–8о С).
Визначення активності α-амілази методом Каравея (з модифікаціями)
Принцип методу: метод базується на колориметричному визначенні концентрації крохмалю до та після його ферментативного гідролізу. Реактиви:
2. Фосфатний буфер (рН 7,4). 0,979 г КН2РО4 розчиняють у 100 мл дистильованої води, 1,787 г Na2HPO4 розчиняють окремо у 100 мл дистильованої води. У роботі використовують буфер, який готують, змішуючи 15 мл розчину КН2РО4 і 50 мл розчину Na2HPO4. Буферний розчин придатний для використання у холодильнику протягом 2–3 тижнів. 3. Основний розчин йоду. 3 г КІ розчиняють у невеликому об’ємі дистильованої води, додають 0,3 г кристалічного йоду і доводять об’єм до 100 мл дистильованою водою. Перед постановкою досліду готують робочий розчин: 2 мл основного розчину змішують з 6 мл дистильованої води.
Хід роботи До 1 мл фосфатного буферу додають 1 мл розведеної у 10 разів сиро-ватки крові (0,1 мл сироватки додати до 0,9 мл 0,9 %-го розчину NaCl). Суміш інкубують у термостаті (37о С) протягом 7 хв. і додають 1 мл розчину крох-малю (субстрату), яку теж попередньо прогрівають у термостаті. Пробу залишають у термостаті ще на 5 хв., після чого додають 0,1 мл 0,1 н розчину HCl. Вміст пробірки перемішують, потім до неї додають 9 мл охолодженої дистильованої води. 1 мл одержаного розчину переносять до іншої пробірки, яка містить 0,5 мл робочого розчину йоду, зтрушують, після чого додають 10 мл дистильованої води і пробу перемішують. Фотометрують у кюветі з довжиною оптичного шляху 1 см при довжині хвилі 630–690 нм (червоний світлофільтр). У якості розчину для порівняння використовують дистильовану воду. Холосту (контрольну) пробу ставлять, як дослідну, але замість розведеної сироватки додають відповідний об’єм 0,9 %-го NaCl. Подальші маніпуляції проводять, як з дослідною пробою. Розрахунок проводять за формулою: , де Е – активність α-амілази, представлена у г / (годּл); Ак – абсорбція контрольної проби; 0,02 – кількість крохмалю (г), доданого до дослідної проби; 12 – коефіцієнт перерахунку на 1 год інкубації; 10 – коефіцієнт розведення сироватки; 1000 – коефіцієнт перерахунку на 1 л сироватки. Після спрощення формула здобуває наступний вигляд: . Показники норми: активність ферменту у сироватці крові – 16–30 г / (год ּл), у сечі – 28–160 г / (год ּл), у середньому –107±5,1 г / (год ּл). Активність α-амілази крові протягом доби може значно змінюватися. Відмічаються істотні індивідуальні відмінності цього показнику у людей без патології органів травлення. На величину показника активності цього ензиму впливає характер харчування: при збільшенні утилізації глюкози вміст амі-лази у крові знижується. Емоційні, стресові стани, навпаки, призводять до гіперамілаземії. Зміни активності α-амілази у крові та сечі відбуваються під час вагітності. Активність α-амілази значно підвищується при захворюваннях підшлункової залози. При гострому панкреатиті активність ферменту у крові та сечі збільшується у 10–40 разів. Активність ферменту може бути підвищеною при таких захворюваннях, як гострий апендицит, перитоніт, гастрит, перфоративна виразка шлунку тощо. Гіпоамілаземія у клінічній практиці зустрічається рідко. Вона відмічається у хворих на гепатіт і цироз, при злоя-кісному рості та метастазуванні у печінці, опіках шкіри, цукровому діабеті, гіпотиреозі, загальних розладах харчування, під впливом інтоксикацій.
Лабораторна робота № 3 ВИВЧЕННЯ ВЛАСТИВОСТЕЙ ЛЕЦИТИНУ
Фосфоліпіди відносяться до підкласу складних ліпідів. Це складні етери багатоатомних спиртів гліцеролу (гліцерофосфоліпіди) та сфінгозину (сфінгофосфоліпіди) з вищими жирними кислотами та фосфорною кислотою. До складу фосфоліпідів входять полярні азотвмісні сполуки (холін, етаноламін, серин) та інозитол. Фосфоліпіди – структурні компоненти біологічних мембран, приймають участь у активації мембранних та лізосомальних ферментів, у проведенні нервового імпульсу, згортанні крові, процесах клітинної проліферації та регенерації тканин. Особлива роль відводиться фосфоліпідам у формуванні ліпопротеїдних комплексів. Фосфоліпід лецитин (фосфатидилхолін) у своєму складі містить холінфосфорну кислоту. Лецитини, у яких група холінфосфорної кислоти сполучена з першим карбоновим атомом гліцеролу, називаються α- лецитинами. У β-лецитинів ця група зв’язана з другим карбоновим атомом гліцеролу. Наявність одночасно позитивного і негативного зарядів обумовлює полярність; частина молекули, що несе залишки фосфорної кислоти та холіну має гідрофільні властивості. Лецитин у воді не розчинюється, але утворює стійку емульсію у вигляді клейстероподібної маси. Ця властивість лецитину сприяє його перетравленню, а також застосовується при виробництві маргарину та у кондитерській справі. Велика кількість лецитину міститься у яєчному жовтку, нервах, головному та кістковому мозку, наднирниках, легенях, серці, а також у грибах і дріжджах.
Осадження ацетоном та хлористим кадмієм Принцип методу. Чистий лецитин – це біла воскоподібна маса, що швидко жовтіє на повітрі. Лецитин добре розчинюється у спирті, хлороформі, етері, бензині, але нерозчинний в ацетоні. Ця властивість дозволяє відділити лецитин від інших ліпідів, розчинних в ацетоні. Обладнання: склянка; скляна паличка; хімічні пробірки; водяна баня; хімічна лійка; складчатий паперовий фільтр. Матеріали та реактиви: жовток куриного яйця; 96%-ий розчин етилового спирту; ацетон; насичений розчин хлористого кадмію.
Хід роботи 1. До склянки внести 1/5 частину одного куриного жовтка, додати при перемішуванні 15 мл 96%-го розчину гарячого етилового спирту. 2. Суміш охолодити, відфільтрувати у суху хімічну пробірку. Якщо у фільтраті з’явилась каламуть, фільтрування повторити до отримання прозорого фільтрату. 3. До другої хімічної пробірки приливають 2–3 мл ацетону і по краплям додають частину фільтрату. Спостерігається поява каламуті в ацетоні, що вказує на випадання в осад лецитину, нерозчиного у цьому органічному розчин-нику. 4. До сухої пробірки внести 1 мл спиртового розчину лецитинів, по краплям додати насичений розчин хлористого кадмію до утворення білого осаду.
Індивідуальні завдання до лабораторних робіт № 1. 1. Надати розрахунки реактивів. 2. Охарактеризувати білок казеїноген. 3. Які фізико-хімічні властивості казеїногену зумовлюють можливість його виділення? 4. Чому у процесі фільтрування при виділенні казеїногену на деяких стадіях використовують простий паперовий фільтр, а на інших – складчатий? 5.Дати визначення ізоелектричної точки. 6. Чинники, що впливають на значення рІ. 7 Механізм осадження білків алкалоїдними сполуками.
Індивідуальні завдання до лабораторних робіт № 2, 3.
Індивідуальні завдання до лабораторних робіт № 3.
Перелік навчальної лiтератури
1. Кучеренко М.Є., Бабенюк Ю.Д., Войцицький В.М. Сучасні методи біохімічних досліджень. К., Фітосоціоцентр, 2001. 2. Практикум по биохимии. Под ред. Северина С.Е. и Соловьёвой Г.А. Москва, Изд-во МГУ, 1989. 3. Филлипович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. М., Просвещение . 1975. 4. Дэвэни Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. М., Мир, 1976. 5. Методы практической биохимии Под ред. Уильямса Б. И Уилсона К. М., Мир, 1978 6. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М., Мир, 1982. 7. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. И., Наука, 1981 8. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.,Наука, 1983 9. Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение. М.,Мир, 1986. 10. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия: Перевод с нем. – М.: Мир, 2000. – 469 с. 11. Рис Э., Стернберг. Введение в молекулярную биологию: от клеток к атому: Пер. с англ. – М.: Мир, 2002. – 142 с.
КомментарииКомментариев пока нет Пожалуйста, авторизуйтесь, чтобы оставить комментарий. |