|
|
Главная \ Методичні вказівки \ Сучасні біотехнологічні методи та виробництва
Сучасні біотехнологічні методи та виробництва« Назад
Сучасні біотехнологічні методи та виробництва 04.02.2015 07:05
ЗМІСТОВИЙ МОДУЛЬ. Фітобіотехнологія. ТЕМА 1. Культура рослинних клітин та тканин. Об’єкти та методи фітобіотехнології. Хемогетеротрофність та тотипотентність рослинних клітин у культурі. Біотехнологічне використання культур клітин та тканин рослин. Калусна клітина – основний тип рослинної клітини у культурі. Відбір експлантатів та методи одержання протопластів: механічний та біохімічний (ензиматичний). Явище соматичного ембріогенезу: прямий та непрямий соматичний ембріогенез. Техніка злиття протопластів. Конспект лекцій
Лекція №1. Тема. Використання методу культури клітин та тканин у створенні сучасних технологій.
Метод культури тканин широко використовується в сільському господарстві і промисловому виробництві. Прикладом може служити масове клональне мікророзмноження декоративних рослин, а також їхнє оздоровлення від вірусних і інших інфекцій. За допомогою культури in vitro можна розширити можливості селекційної роботи: одержувати клони кліток, а потім і рослини з запрограмованими властивостями. Завдяки здатності кліток синтезувати в культурі вторинні метаболіти виникла галузь промисловості, що здійснює біологічний синтез речовин, необхідних людині. В даний час відомо приблизно 210 синтезованих рослинами речовин, що використовуються людиною, і їхня кількість постійно збільшується. Рослини завжди служили джерелом їжі, ефірних олій, барвників і, звичайно ж, лікарських речовин. Так, мак снотворний ( род. Рараvеr ) є джерелом болезаспокійливої речовини — кодеїну; з наперстянки (род. Digitalis) одержують дигоксин, що тонізує серцеву діяльність; з хінного дерева — антималярійний засіб «хінідін». Особливе місце займають наркотики і стимулюючі речовини. У невеликих, строго контрольованих кількостях їх використовують у медицині. Великий інтерес викликало відкриття пиретринів, виділених з квіток Сhrуsапthemum cinerariaefolium. Ці речовини — могутні інсектициди. Особлива їхня цінність полягає в тім, що пиретрини не викликають звикання в комах, а також не виявляють кумулятивного токсичного ефекту. Здатність рослин синтезувати різні біологічно активні речовини привела до припущення, що тим же властивістю будуть володіти клітки і тканини цих рослин, які будуть вирощені в стерильних умовах. Для деяких культур це виявилося справедливим, Але в окремих випадках клітки або не виявляли здатності до синтезу необхідних речовин, або синтезували їх у мінімальних кількостях. Знадобилися довгі експерименти по підбору живильних, середовищ умов культивування, дослідженню нових штамів, отриманих завдяки генетичній гетерогенності калусних клітин або застосуванню мутагенних факторів, щоб домогтися серйозних успіхів у цій області. Технології, що полегшують селекційний процес Одна з найбільш важливих технологій цієї групи - запліднення in vitro, що допомагає запобігти прогамну несумісність, що може бути викликана наступними причинами: 1) генетично детермінована (визначена) невідповідність секрету рильця материнської рослини і пилка батьківського, яка гальмує ріст пилкових трубок на рильці маточки; 2) невідповідність довжини стовпчика маточки і пилкової трубки, у результаті чого пилкова трубка не досягає сем’япочки (гетеростиля); 3) тканева несумісність партнерів, що призводить до зупинки росту пилкової трубки в будь-який момент її проростання від рильця маточки до мікропилку сем’япочки (гаметофитний тип несумісності). Подолання прогамної несумісності можливо завдяки вирощуванню в стерильних умовах ізольованої зав'язі з нанесеним на неї пилком або ізольованими шматочками плаценти з сем’япочками, поруч з якими або безпосередньо на тканині, яких культивується пилок. Значною перешкодою для селекції служить також постгамна несумісність, викликана різним по часу розвитком зародка й ендосперму при віддаленій гібридизації. У результаті утворяться невсхожі щуплі насіння. Отримати рослину з такого насіння можна тільки при використанні методу ембріокультури - вирощування ізольованого зародка на штучному живильному середовищу. Метод ембріокультури широко застосовують при міжвидової гібридизації овочевих рослин, для мікророзмноження штучних гібридів, для клітинної селекції. Існує кілька методів клітинної селекції: 1. Пряма (позитивна) селекція, при якій виживає тільки заданий тип мутантних клітин. 2. Непряма (негативна) селекція, що веде до загибелі клітин дикого типу, які діляться, і виживанню метаболично неактивних клітин. Цей прийом вимагає додаткової ідентифікації мутаційних змін у клітин , що вижили. 3. Тотальна селекція, при якій індивідуально тестуються усі клітинні клони. 4. Візуальна селекція і неселективний добір, коли необхідна варіантна лінія вибирається серед інших візуально або з допомогою біохімічних методів. Гібридизація соматичних клітин. Безліч теоретичних і практичних задач дозволяє вирішувати використання ізольованих протопластів. З їхньою допомогою можна вести селекцію на клітинному рівні, працювати в малому обсязі з великим числом клітин, здійснювати прямий перенос генів, вивчати мембрани, виділяти пластиди. Ізольований протопласт – це вміст рослинної клітини , оточений плазмолемою. Целюлозна стінка в даного утворення відсутня. У 1971 р. Такебе і його співробітники, обробляючи клітки листа тютюну для розчинення клітинних стінок сполученням целюлази і пектинази, домоглися успіху в одержанні протопластів. Протопласти культивували в середовищі, у якій вони могли поділятися і формувати калюс, здатний до регенерації з утворенням цілої рослини. Ці перші експерименти, проведені на протопластах тютюну, показали, що більш 90 % усіх протоклонів, тобто клонів, отриманих з протопластів, дивно подібні з батьківськими лініями, як по фенотипу, так і по генотипу. Таким чином, протопласти тютюну дозволили перебороти звичайну мінливість, характерну для інших способів одержання клонів. Виявлена стабільність була підтверджена і на деяких інших видах рослин. У 1974 р. Дж. Мельхерсом був введений у практику термін «соматична гібридизація», що означає процес злиття протопластів соматичних клітин . При соматичній гібридизації розвиваються гібриди, що поєднують геном обох клітин. Соматична гібридизація має важливі особливості: по-перше, цьому процесові доступні практично будь-які схрещування, у- других, злиття протопластів сприяє об'єднанню цитоплазматичних генів батьківських клітин, чого не буває при схрещуванні полових клітин. Мимовільне злиття протопластів відбувається дуже рідко. Механізм цього процесу до кінця не з'ясований. Однак відомо, що протопласти мають негативний поверхневий заряд, що викликає їхнє взаємне відштовхування. Уперше штучне злиття протопластів за допомогою індуктора злиття (ф’юзогена) було здійснено в 1970 р. Коккінгом і його співробітниками. Перший нестатевий гібрид вищих рослин був отриманий у 1972 р. при злитті ізольованих протопластів двох видів тютюну: Nicotiana glauca і Nicotiana langsdorfii. У 1978 р. було зроблено успішне злиття протопластів картоплі і томатів. Отримані рослини «томату» представляють не тільки науковий, але і практичний інтерес, оскільки вони утворять бульби і плоди. На відміну від томатів картопля належить до видів, що важко піддаються генетичному поліпшенню. Фактори стійкості до хвороб, скомбіновані в одному сорті томатів, при застосуванні методу злиття протопластів можуть бути перенесені в сорт картоплі в ході однієї операції. Аналогічна робота, проведена з використанням звичайних селекційних прийомів, зайняла б близько 20 років. В даний час отримано багато міжвидових, міжродинних гібридів, значну частину, яких не можна вважати нормальними рослинами. Виникаючі аномалії — результат хромосомної незбалансованості. Описані випадки виникнення гібридів між протопластами еритроцитів пацюка і дріжджових кліток, моркви і людини й ін. Будь-які дослідження, будь-які маніпуляції в області створення нових генотипів повинні бути ретельно і всебічно продумані, а вчені повинні пам'ятати про відповідальність і наукову етику. У 1964 р. Індійські дослідники Гуха і Махесвари культивували в штучному середовищі пильовики рослин, пилкові зерна яких утворили ембріони, а потім і гаплоїдні рослини. Сангван і Сангван-Норилл у 1976 р. домоглися успіху в культивуванні пилкових зерен, виділених з пильовиків рослин сімейства Solanacea. Пилкові зерна розвивалися кілька днів у своїх пильовиках, після цього їх виділяли для культивування. Таким способом удалося одержати життєздатні рослини. Культуральне середовище в досвідах такого роду містить до 10000 пилкових зерен на 1 мол, але навіть при самому ретельному дотриманні необхідних умов далеко не всі з них дають початок розвитку андрогенних рослин (у досвідах - 9%). Культура пилкових зерен стала основним джерелом гаплоїдних рослин у декоративних, овочевих, зернових і кормових видів. Пилкові зерна можуть виявитися більш зручними, чим протопласти, для експериментів по генетичної трансформації, призначених для одержання рослин з заданими властивостями. Рослини, отримані в результаті розмноження вегетативним шляхом (клони), звичайно схожі на батьківську рослину, але не всі клони генетично однакові. Іноді виникають клони, що істотно відрізняються від вихідної форми. Їх називають соматичними варіантами, сомаклонами або «спортами», і з'являються вони в результаті генетичних змін у клітинах меристеми, що дають початок усій новій рослині або його частини. Сомаклональна мінливість – прекрасне джерело генетичної розмаїття, що може використовуватися при створенні генетично змінених організмів з новими властивостями. Відзначено випадки появи сомаклональних варіантів, що сполучать ознаки, що неможливо або важко з'єднати в одному генотипі традиційним селекційним шляхом. Так, з сомаклональних варіантів, що виникли в калусній культурі рису, були виділені рослини, що сполучили скоростиглість і “довгі зерна”. На їхній основі за короткий термін був створений новий сорт рису. У ряді випадків розмноження спортів привело до створення нових сортів. Наприклад, апельсини «Навель», персики-нектарини. Таким чином, мінливість протоклонів, що спостерігається в відсутність мутагенів, досить важлива для селекції: завдяки їй селекціонери одержують багатий вихідний матеріал.
Лекція 2. Лікарська сировина, вирощена методом культури клітин і тканин (ч.1)
Культура рослинних клітин і тканин ґрунтується на вирощуванні недиференційованої калюсної маси в стерильних умовах на штучних поживних середовищах. Калюс являє собою однорідну недиференційовану біомасу, що виростає з експлантата (ізольований сегмент частини рослини) на поживному середовищі в асептичних умовах. У природі калюсоутворення зустрічається як реакція на пошкодження рослини, коли на місці поранення утворюється наріст (мозоль). Від інфекції калюс захищають імунні механізми організму. Метод культури клітин і тканин широко застосовується у різних галузях біології завдяки простоті тканинних та клітинних моделей у порівнянні з рослинним організмом, а також завдяки можливості точно регулювати ріст та розвиток ізольованих систем і контролювати метаболізм. Одна з важливих особливостей культури клітин і тканин — збереження здатності до синтезу вторинних речовин, притаманних вихідній рослині. Культура клітин і тканин — порівняно молода галузь науки. Вперше культуру тканин барвінку рожевого отримав Уайт у 1945 році. В СРСР освоєння методу культури тканин розпочато з кінця 50-х років XX століття і пов'язане з ім'ям Р.Г. Бутенко. Роботи О.Г. Воллосовича з культурою тканин стебла раувольфії зміїної привели до створення високопродуктивних аймаліноміст-ких штамів, а при культивуванні клітин кореня раувольфії зміїної були отримані штами, котрі синтезують удвічі більше резерпіну, ніж вихідні клітини. Досягнуто певних успіхів у культивуванні раувольфії зміїної, барвінка рожевого, стефанії гладенької, дурману індійського, женьшеню звичайного, деяких видів наперстянки. Із культивованих тканин виготовляють препарати "Аймалін","Вінбластин", "Вінкристин", "Екстракт кореня женьшеню". У Росії біохімічні заводи виготовляють клітинну біомасу женьшеню і високоаймалінові штами раувольфії зміїної. Вирощування культури тканини відбувається значно швидшими темпами у порівнянні з ростом цілої рослини. Наприклад, корінь женьшеню масою 50 г у природних умовах виростає при значних затратах праці за б років, а в колбі тканину такої ж маси отримують за 7-8 тижнів. Кожній тканині притаманний певний рівень мітотичної активності, зміна якого нерідко має чітко виражений ритмічний характер. В експерименті необхідно враховувати, в який час доби спостерігається максимальна кількість мітозів у досліджуваній тканині. У багатьох рослин максимум мітозів відзначається вночі, а мінімум — вдень. Було встановлено, що в моменти інтенсивного поділу клітин відбувається активне накопичення алкалоїдів у тканинах, яке поступово знижується по мірі зменшення мітотичної активності і досягає мінімуму під час інтенсивного розтягнення клітин. При цьому в залежності від сезону приріст біомаси (дурман індійський та скополія гімалайська) мало змінюється, але значно коливається кількісний вміст діючих речовин. Кожна окрема культура ізольованих тканин має свої цитологічні, генетичні, морфологічні й синтетичні особливості. Тому необхідно всебічно вивчати кожну калюсну культуру — продуцент діючих речовин. Передумовами для організації культури клітин і тканин вищих рослин у біотехнологічній промисловості є: 1. їхня здатність синтезувати продукти рослинного походження, що традиційно використовуються. Це алкалоїди, глікозиди, тритерпеноїди, стероїди, феноли, вітаміни, природні барвники (пігменти) тощо. 2. Можливість утворення принципово нових продуктів, що перевищують за якістю традиційні. 3. Здатність трансформувати дешеві попередники на кінцевий цінний продукт. При вирощуванні клітинних культур вищих рослин можна успішно використовувати методи і техніку мікробіологічного виробництва. Клітинні культури вищих рослин порівняно із традиційною рослинною сировиною мають ряд переваг: • можливість одержання продукту незалежно від клімату, сезону, погоди, ґрунтових умов; • оптимізація та стандартизація умов вирощування; • перспективи повної автоматизації та комп'ютеризації процесів. Культура тканин вищих рослин має велике значення для швидкого клонального (нестатевого) мікророзмноження рослин in vitro, строго тотожних із вихідними рослинами. Найлегше викликати утворення тканин та органів і регенерацію рослин, стійких до вірусів, використовуючи зародки і бруньки, а також стеблові меристеми. Для культивування ізольованих клітин і тканин вищих рослин застосовуються як агаризовані, так і суспензійні середовища. При вирощуванні в суспензійному середовищі значно скорочується цикл технологічного процесу. Однак необхідність постійно перемішувати суспензійні культури, а також продувати стерильне повітря вимагає спеціальної апаратури, що, звісно, ускладнює процес. Тому вирощують культури в рідкому поживному середовищі на "підкладинках". Унікальною моделлю для вивчення фундаментальних проблем фізіології рослин, таких, наприклад, як транспорт поживних речовин у клітині, склад і механізм регенерації клітинної стінки, моделювання метаболізму за відсутності міжклітинних зв'язків, слугують ізольовані протопласти. Важливою галуззю практичного застосування протопластів є отримання гібридів вищих рослин шляхом злиття протопластів за допомогою соматичної гібридизації. Суть методу полягає у тому, що як батьківські використовуються не статеві клітини (гамети), а вирощені in vitro соматичні клітини у вигляді протопластів. Гібридизацію рослинних протопластів успішно здійснюють за певного впливу — або електростимуляцією примушують зливатися один з одним, або мікроін'єкцією РНК однієї клітини в іншу. Гібридні клітини продукують не лише метаболіти вихідних рослин, але й цілком інші. Із гібридних клітин, одержаних таким шляхом, у подальшому регенерують цілі рослини-гібриди. Цікавим є також утворення штучних асоціацій міжклітинного та внутрішньоклітинного типів на основі культивованих клітин або ізольованих протопластів вищих рослин з мікроорганізмами. Одним з головних факторів утворення ефективної біотехнологічної системи культури тканин та клітин вищих рослин є правильний вибір поживного середовища, яке б забезпечувало потреби клітин продуцента у хімічних компонентах, необхідних для оптимального біосинтезу цільового продукту. Однак дослідження останніх років показали, що утворення вторинних метаболітів, наприклад, алкалоїдів, може швидко змінюватися під впливом стресових факторів. Спостерігали активацію синтезу алкалоїдів у тканині раувольфії зміїної при дефіциті компонентів поживного середовища, гіпоксії, зміні температури та освітлення, рН поживного середовища та впливі іонізуючого опромінення. Відповідна реакція клітин часто буває досить швидкою, і вміст деяких алкалоїдів збільшується у десятки разів. Культура калюсу Здатність до синтезу необхідних продуктів метаболізму залежить в основному від вихідної структури експлантатів, від їх наступних гістологічних особливостей, від їх диференціації в процесі калюсогенезу і від цитогенетичної характеристики клітин, добір яких йде від пасажу пересівання до пасажу, а також і від специфіки поживного середовища. Для культивування клітин та тканин рослин застосовують різні поживні речовини. До їх складу входять макроелементи: S, Р, К Са, Мg; мікроелементи: Мn, В, Zn, Мо, І, Сu, Со; вітаміни: тіамін нікотинова кислота, біотин, рибофлавін, пантотенова кислота; вуглеводи: сахароза, глюкоза, фруктоза, лактоза; три групи фітогормонів: цитокініни, ауксини, гібереліни. Цитокініни — кінетин, зеатин та інші синтезуються у коренях рослин. Вони відіграють першорядну роль у процесі диференціювання клітин, що приводить до утворення калюсної тканини, уповільнюють старіння органів. Ауксини — 2,4-дихлорфеноксіоцтова кислота (2,4-Д), індомасляна кислота (ІМК), нафтілоцтова кислота (НОК) — синтезуються в апікальній меристемі стебла, меристемі кореня. Ауксини впливають на поділ, розтягнення, диференціювання клітин, стимулюють регенерацію пагонів і утворення коренів. Гібереліни - визивають і підсилюють ріст і витягування стебла, листків, знімають стан покою у листках і насінні, їх вносять у середовище для прискорення формування надземної частини рослин. Найчастіше - застосовуються поживні середовища Мурасиге- Скуга, Шенка-Хильдебрандта та інші. На першому етапі, відразу після стерильного виділення частини рослини, до складу поживного середовища часто вводять антиоксиданти — цистеїн, глутатіон, етанол, аскорбінову кислоту, які запобігають активації гідролітичних ферментів і загибелі експлантата. На цьому ж етапі для всмоктування шкідливих продуктів метаболізму, що виділяються експлантатами, до середовища вносять активоване вугілля. Але останнє адсорбує і необхідні клітинам фітогормони, тому у присутності вугілля кількість фітогормонів має бути збільшена на порядок проти звичайної. На початковому етапі культивування клітин і тканин у поживні середовища вводять дріжджовий екстракт, гідролізат козеїну, амінокислоти тощо. Ці речовини провокують проростання спор і дозволяють виявити приховану інфекцію в експлантатах. У подальшому на етапі переприщеплюваного культивування (вирощування перепришеплених клітин та тканин) використовують стандартні поживні середовища, до складу яких, в залежності від мети робот, вводять необхідні концентрації фітогормонів. У наш час виробляють кілька типів готових поживних середовищ у вигляді сухих порошків, що містять усі необхідні компоненти, за винятком регуляторів росту, сахарози та агару. Готові середовища зручні для культивування відомих калюсних культур, але при вирощуванні нових тканин необхідний пошук оптимального поживного середовища для кожного об'єкта індивідуально. Стерилізацію поживного середовища проводять способом автоклавування. Не можна цим способом стерилізувати регулятори росту. Для приготування напівтвердих середовищ агар у готове середовище вводять перед автоклавуванням. При перенесенні стерильних експлантатів у стерильне поживне середовище паренхімні клітини дедиференціюються, втрачають клітинну спеціалізацію, переходять до ділення, утворюючи однорідну біомасу, що отримала назву калюсу. Незалежно від того, з якого органа був отриманий первинний калюс, він є однотипною масою клітин, які лише частково відтворюють специфіку тканини інтактної рослини. Культуру калюсу звичайно підтримують на поверхні твердого агаризованого середовища, періодично пересіваючи. Вплив тривалості культивування тканин і клітин і кількість пасажів можуть визвати помітні зміни як у рості і морофології тканин, так і в їх біохімічних властивостях. В результаті цитогенетичної мінливості калюсні клітини втрачають здатність щодо реалізації генетичної інформації і утворення тих чи інших вторинних сполук. В той же час вихідна генетична інформація не зникає цілком, але для її реалізації потрібні специфічні умови. До таких факторів відносяться світло, фітогормони, складові живлення. Так, наявність у середовищі кінетину стимулює накопичення у калюсній культурі тканин тютюну нікотину і лігніну, а низька концентрація сахарози спричиняє накопиченню у цих клітинах убихінону-10. Пріоритет у калюсоутворенні, що довгий час належав меристематично активним тканинам, зараз значною мірою затвердився за живими паренхімними клітинами. Саме вони, як такі, що зберегли протягом довгого часу здатність переходити в меристематично активний стан, відіграють першочергове значення при калюсогенезі взагалі та в умовах стерильної культури тканин in vitro зокрема. Щоб забезпечити розвиток калюсних клітин на поживних середовищах, які містять всі необхідні для росту речовини, клітини експлантатів мають втратити здатність диференціюватися. Цьому сприяє передінкубація експлантатів на середовищі без гормонів протягом 3-6 діб. Процес калюсогенезу в умовах ізольованої культури тканин багатьох видів рослин звичайно проходить у три етапи: • дедиференціація тканин експлантата; • меристематизація; • диференціація знов виникаючих тканин калюсу. Перший етап — дедиференціація — проходить дуже швидко і зачіпає лише деякі з судин та особливо ділянки паренхімних тканин, що знаходяться на кордоні зрізів. З перших днів була відзначена висока проліферація (розвиток) паренхімних тканин, що прилягають до судин. На експлантатах з зони сформованої флоеми була відзначена висока проліферативна активність епітеліальних клітин секреторних каналів та канальців. Результатом усіх цих змін є формування первинного калюсу. Морфологічно він ще не виражений, але в усіх експлантатах буквально з перших днів відбуваються гістолоіічні зміни, пов'язані в основному з дедиференціацією паренхімних клітин (по кордонах зрізів, поблизу провідних шляхів) та їх першими діленнями. Другий етап — меристематизація — характеризується перетворенням структури первинного калюсу і появою перших меристематичних осередків. Поблизу верхньої поверхні калюсів проходить формування багаторядної, суцільної "захисної", або покривної зони. На нижній стороні спостерігалося формування тільки окремих меристематичних осередків. Нижня поверхня ставала нерівною, отримувала бугристий характер. В експлантатів зберігалася висока проліферативна активність усіх паренхімних клітин. Структура первинного калюсу з першими меристематичними осередками і зонами поступово отримує риси будови калюсу вторинного. На 10-й день досліджень усі калюси (випробовувались трансплантати з зони сформованої ксилеми, камбію, сформованої флоеми) були морфологічно чітко окреслені. Вони виділялись у вигляді сплошної світло-жовтої маси з верхньої сторони та рихлої бугристої, більш темного кольору — з нижньої. На третьому етапі калюсогенезу — диференціації — тривала активна меристематизація. Вона відбувалася у формуванні додаткових меристематичних осередків, а також у подальшій диференціації раніш закладених меристематичних осередків. Спостерігався перехід його до структури вторинноперетвореного калюсу. Для останнього найбільш характерним є проява органогенетичних потенцій. Так, на 72-й день у культурі ізольованих тканин женьшеню можна було спостерігати утворення великої кількості білих коренів довжиною до 1,5 см. Таким чином, виявилося, що калюсогенез на різних експлантатах з кореня женьшеня йде однотипно. Цей процес в умовах стерильної культури характеризується динамікою формування усіх структур, що визначає його етапність і закономірність у локалізації гістологічних елементів у сформованому, зрілому стані. Утворений таким чином на тканинах первинного експлантата калюс є морфологічно новою структурою. Характер його формування, як і тривалість протікання вказаних етапів, багато в чому обумовлюється гістологічними особливостями первинних експлантатів. Незважаючи на різні гістологічні ознаки, що є в кожному окремому випадку, в калюсогенезі можна виділити окремі загальні структурні закономірності. Останні як в травматичному калюсогенезі, так і при утворенні калюсів у стерильній культурі, можна називати первинними, первинноперетвореними, вторинними та вторинноперетвореними, що відповідає вказаним вище загальним етапам калюсогенезу у випадках початкового введення тканин в стерильну культуру in vitro. Протягом пасажу морфологія калюсу і його клітин змінюється, що пов'язано з проходженням чотирьох стадій росту: латентний період, тобто період від пересадки до початку мітотичної активності — росту немає; період інтенсивного поділу — калюс більш або менш щільний, складається із багатьох меристематичних ділянок клітин, що діляться; період розтягнення клітин — калюс стає більш рихлим, клітини в ньому лежать вільно, поділу майже немає; стабільна стадія — клітини сильно вакуолізовані, калюс набуває липкої консистенції. Ще одна особливість у культурі калюсу — в найзовнішніших шарах "захисної" зони калюсу можна спостерігати утворення груп дрібних "дочірніх" клітин, що виникають з однієї "материнської". Це явище пов'язують з соматичним ембріогенезом. Такі загальні особливості формування калюсів виявлені при первинному введенні гістологічно різних тканин в стерильну культуру (на прикладі кореня женьшеня). Лекція 3. Лікарська сировина, вирощена методом культури клітин і тканин (ч.2) Вирощування на агаризованому середовищі. Для приготування агаризованого середовища додають агар до поживного середовища до кінцевої концентрації 6-10 г/л. Значення рН середовища перед автоклавуванням доводять до 5.5-6,0. В асептичних умовах калюс (60-100 мг) відокремлюють і розміщують на поверхні агаризованого поживного середовища для подальшого росту. В результаті отримують культуру калюсної тканини, яку можна підтримувати безмежно довго, періодично її пересіваючи на нове поживне середовище. Ріст тканини на агаризованому середовищі протягом пасажу характеризується S- образною кривою, до якої входять 4 фази (на прикладі кореня женьшеня). Перша фаза — лаг-фаза, тривалість якої не більше двох діб. У цей час клітини практично не поділяються і середній розмір їх не змінюється у порівнянні з розмірами клітин вихідної рослини. Друга фаза — фаза експоненційного росту, триває приблизно 20 діб. Для цієї фази характерна найбільша мітотична активність клітин. Максимальна кількість клітин, що діляться, випадає на 5-у та 15-у добу культивування. При цьому середній розмір клітин зменшується, приріст біомаси женьшеня на цій стадії вирощування складає 13-14 г з 1 л середовища на добу. Третя фаза — фаза лінійного росту, характеризується найбільш інтенсивним накопиченням біомаси. Приріст тканини на 25—28-у добу складає 350-400 г/л на добу. В цій фазі мітотична активність зменшується, клітини збільшуються у розмірі, у них спостерігається накопичення глікозидів. На 30-у добу знижується вміст сухої речовини, стабілізується накопичення панаксозидів. Для четвертої фази — стаціонарного росту — характерна часткова загибель клітин та поява некротичних зон. У зв'язку з цим для підтримування культури в активному стані її необхідно пересівати на свіже поживне середовище на 30-у добу вирощування. Ріст культури тканини протягом пасажу супроводжується змінами рН середовища. Протягом лаг-фази і фази експоненційного росту відбувається "підкислення" середовища в основному за рахунок поглинання відновлених форм азоту. У фазі лінійного росту спостерігається "підлужування" середовища, зв'язане з активним виносом із нього і накопиченням у тканині нітратних форм азоту. Наприкінці пасажу тканина починає поглинати аміачні форми азоту, що призводить до "підкислення" середовища. Динаміка накопичення розчинних цукрів у тканині женьшеня корелює з мітотичною активністю. Максимальна кількість цукрів накопичується у фазі експоненційного росту на 5-у та 15-у добу культивування, а по мірі накопичення біомаси (у фазі лінійного росту женьшеня) кількість цукрів в тканині різко знижується. Якісно амінокислотний склад культури тканини женьшеня в процесі культивування не змінюється. Кількісний вміст як вільних, так і зв'язаних амінокислот залежить від фази росту. Так, вільних амінокислот найбільше накопичується у фазі експоненціального росту (це, очевидно, зв'язано з активністю їх включення у процеси обміну); фази лінійного і стаціонарного росту характеризуються зменшенням кількості вільних і збільшенням вмісту зв'язаних амінокислот. Культивування тканин на твердих поживних середовищах відбувається часто у різноманітних установках, де багато процесів механізовані. Процес отримання культури клітин твердофазним способом потребує використання занадто великих площ, не гарантує стерильності і дає низький вихід продукту. Вирощування в суспензійних культурах. Суспензійними називають культури, вирощені глибинним способом у рідкому поживному середовищі. Вони складаються переважно із окремих клітин та невеликих їх агрегатів. Для отримання суспензійних культур рослинних клітин використовують культури калюсних тканин, які мають бути рихлими, легко розпадатися на невеликі клітинні агрегати (по 5- 10 клітин) і окремі клітини. Суспензійні культури отримують із найбільш життєздатних (проліферуючих) частин калюсної тканини. Перед пересіванням первинну культуру фільтрують крізь два шари марлі або крізь сита (нейлонові, металеві) для того, щоб відокремити крупні агрегати калюсної тканини та залишки трансплантата. На 60-100 мл середовища беруть 23г свіжої калюсної тканини. Можна використовувати також спеціальні металеві або скляні ферментатори різноманітної конструкції (з мішалками або барбатерного типу). Біосинтез проводять в апаратах, що мають обсяг від 0,1 до 63 м3. Процес культивування рослинних клітин займає 2-3 тижні. Ріст суспензійних культур звичайно оцінюють по одному чи кількох параметрах: обсягу осаджених клітин, кількості клітин, сирій та сухій масі, вмісту білка, провідності середовища, життєздатності клітин. Поживне середовище для вирощування суспензійної культури може використовуватися те ж саме, що й при вирощуванні на агарі, але його збагачують ростовими факторами, фітогормонами, в деяких випадках збільшують кількість ауксинів та зменшують кількість цитокінінів. Добрі результати дає повернення суспензійних культур на агаризоване середовище зі зворотним пересівом до рідкого середовища. Лінії культивованих клітин, які швидко ростуть, одержують за допомогою мутагенезу. При вирощуванні суспензійних культур дуже важливо підтримувати постійними режими аерації та перемішування, відповідну температуру, рН середовища, освітленість від 0 до 5 000 люксів. Рост клітин пригнічується при незадовільній кількості кисню, субстрату, наявності токсичних продуктів обміну, накопиченням СО,. При перемішуванні клітини одержують механічний стрес, що може знижувати продуктивність суспензійних культур. Надзвичайно важливим для глибинного вирощування рослинних клітин у ферментерах є запобігання надмірному ціноутворенню та злипанню біомаси на внутрішніх поверхнях вище рівня культуральної рідини, а тому підбір поверхнево-активних речовин (ПАР) становить актуальну проблему технології глибинного вирощування клітин рослин. Процес культивування ведуть доти, доки триває інтенсивний синтез цільового продукту і доки не будуть вичерпані поживні речовини середовища. При визначенні кінця культивування необхідно враховувати дані мікроскопічного контролю стану культури (можливе утворення клітин, які некротують), відсутність сторонньої мікрофлори, концентрацію основних поживних речовин, рН поживного середовища біомаси тощо. Відомо, що вирощування культур тканин у рідких поживних середовищах у кілька разів скорочує терміни культивування штамів. Біомаса суспензійного штаму кореня женьшеня, термін вирощування якої майже у півтора раза менший, ніж на агаризованому середовищі, за основними фітохімічними показниками не поступається природній сировині. Настойка кореня женьшеня, отримана з суспензійного штаму женьшеня, за всіма показникам задовольняє вимогам ТФС-42-353-72. Стимулююча дія настойки з суспензійного штаму має показник 155,5%; з твердого поживного середовища — 133,38%, а настойки з кореня женьшеня — 145,75 %. Використання рідких поживних середовищ дає додаткові можливості для вивчення процесів розвитку рослинних клітин і біосинтезу ними вторинних метаболітів у керованих умовах. Вирощування на "підкладинках". Лише для деяких штамів рослинних культур сьогодні можуть бути використані методи глибинного культивування. Це пояснюється передусім труднощами у досягненні гомогенізованого росту клітин або їх невеликих агрегатів. У зв'язку з цим викликає цікавість метод, який комбінує використання рідкого поживного середовища та твердого матеріалу, що підтримує тканину на поверхні — "підкладинок". Першим матеріалом при культивуванні рослинних тканин на рідких середовищах з використанням "підкладинок" був фільтрувальний папір. При такому способі вирощування можна здійснити спрямований синтез вторинних речовин шляхом регулювання вмісту компонентів харчування, рН середовища, аерації та інших важливих параметрів культивування. Одним з найважливіших елементів поверхневого вирощування тканин на рідких середовищах є вибір "підкладинки", на якій розміщують тканини. З цією метою використовують паперові фільтри, намистинки зі скла Пірекса, кварцовий пісок, поліакриламідні гелі, пластмаси, пінополіуретани. При такому методі вирощування вторинні метаболіти (алкалоїди) накопичувалися, в основному, в біомасі, а вміст їх в рідкому поживному середовищі складав не більше 54 % від їх загальної суми. Слід відзначити, що вихід біомаси і алкалоїдів у цьому випадку був не нижчий, ніж при вирощуванні на агаризованих середовищах, а використання основних компонентів харчування — сахарози, неорганічного фосфору, загального азоту — проходило більш повільно, ніж при глибинному способі вирощування. Для керування процесами росту культур та синтезу ними вторинних продуктів необхідний контроль за кількістю поживних речовин у середовищі. Середовище протягом усього пасажу повинне містити компоненти живлення у кількостях, що забезпечують високу швидкість росту тканин. Відомо, що основною причиною уповільнення росту є виснаження поживного середовища. Тому удосконалення методів глибинного культивування здійснюватиметься шляхом утворення проточних режимів з постійним підтриманням основних компонентів середовища в оптимальній концентрації. При культивуванні на рідких середовищах поверхневим методом "на підкладинці" споживання тканиною головних компонентів живлення — сахарози, неорганічного фосфору та загального азоту — менше, ніж при глибинному способі вирощування. Симбіотичні асоціації на основі культивованих клітин та ізольованих протопластів. У теперішній час провадяться роботи, що направлені на отримання штучних асоціацій на основі культивованих клітин чи ізольованих протопластів вищих рослин з мікроорганізмами. Протопластами називають клітини рослин, повністю позбавлені клітинної стінки, що мають лише клітинну мембрану, яка обмежує цитоплазму. Протопласти отримують обробкою клітин, що ростуть у суспензії, розчином ферментів, який містить пектиназу. целюлазу, геміцелюлазу та глюкозу, мінеральні солі, фосфатний буфер з рН 5,7-6,0. Процедура руйнування клітинних стінок протягом 30-60 хв. при 4-8°С викликає стан шоку клітин, що позначається на збільшенні вакуолізації цитоплазми, появі численних ліпідних краплин тощо. Відмиті від ферментних препаратів протопласти виходять з шокового стану, потім у них спостерігається відновлення (репарація) пошкоджених структур і розпочинається підготовка до відродження (регенерації) клітинної стінки і поділу. Щоб відвернути відродження клітинної стінки, до складу середовища вводять кумарин у концентрації 200-250 мг/л для культивування протопластів, а для стабілізації протопластів — осмотичні стабілізатори (наприклад, сорбітол, манітол) — 125 мг/л. Перебування протопластів у такому середовищі протягом 48 годин не призводить до втрати ними життєздатності, а відмиті від кумарину і стабілізаторів, вони здатні на спеціально підібраному поживному середовищі створювати нові клітинні стінки, ділитися, давати початок рослинам-гібридам. Середовище для культивування протопластів повинно мати рН в межах 5,5-5,8, температуру 22-28°С, освітлення 100-2000 люксів. Зменшення рН середовища до 3,5 призводить до швидкого руйнування (за кілька хвилин) протопластів більшості видів рослин. При отриманні асоціацій використовується різноманітний вибір видів рослинних об'єктів та мікроорганізмів, причому останні представлені азотофіксуючими формами. Вибір ціанобактерій для отримання штучних асоціацій зумовлюється їх властивостями: • здатність до фотосинтезу в об'єднанні з азотофіксацією; • поширення у природних асоціаціях з різними, далеко розташованими у таксономічному відношенні, групами рослин. Утворення такого роду асоціацій представляє інтерес у вирішенні таких практичних задач, як: • підвищення продуктивності культивованих рослинних клітин, продуцентів економічно важливих речовин; • моделювання природних симбіотичних відносин рослин і мікроорганізмів для вивчення фіксації молекулярного азоту; • отримання рослин з новими властивостями.
Індивідуальні завдання
Методичні рекомендації до практичних занять з курсу «Сучасні біотехнологічні методи та виробництва
Практичне заняття №1. Тема Розрахунок компонентів цукрового сиропу і колера та компонентів купажного сиропу.
Розрахунок компонентів цукрового сиропу і колера Цукровий сироп входить до складу купажів безалкогольних і слабоалкогольних напоїв, товарних сиропів, квасу. Розрізняють білий і інвертований цукровий сироп. Білий цукровий сироп являє собою концентрований водний розчин сахарози. У безалкогольному виробництві використовують сироп з концентрацією сухих речовин 60–65%. Інвертований цукровий сироп містить, крім сахарози, інвертний цукор (суміш еквімолекулярних кількостей глюкози і фруктози). Інвертування цукрового сиропу проводять при температурі 70°С в присутності органічних кислот, наприклад, лимонної. Для варіння цукрового сиропу дозволяється використовувати промивні води, що містять цукор, і чистий брак напоїв. Колер — це водний розчин карамелізованної сахарози. Його використовують для підфарбовування товарних сиропів, безалкогольних напоїв і квасу. Колер готують при температурі 180–200°С в колероварочних казанах з електрообігріванням. Для плавлення цукру додають 2% води, після розплавлювання цукру і побуріння маси вносять додатково 8% води від маси цукру. Зміст сухих речовин у готовому колері не менш 70±2% масових. Приклади Приклад 1. Розрахувати витрати компонентів на готування 500 л цукрового сиропу концентрацією 65%, якщо при варінні сиропу випаровується 10% води. Рішення. По додатку 10 знаходимо, що цукровий сироп концентрацією 65% при 20 єС має відносну щільність 1,319. Маса 500 л такого сиропу складе 500 1,319=659,5 кг. Відповідно до заданої концентрації 100 кг сиропу повинні містить 65 кг цукру і 35 кг води, а в перерахуванні на 500 л 659,5 0,65=428,675 кг цукру, 659,5–428,675=230,825 кг води. Оскільки товарний сахарин-пісок має вологість 0,15%, фактично цукру необхідно задати кг. Води з урахуванням утрат на випар буде потрібно 230,825∙ 1,1=253,9 кг. Приклад 2. Розрахувати витрати компонентів на готування 100 кг колера зі змістом сухих речовин 70%, якщо втрати при варінні колера складають 28% від маси сухих речовин цукру. Рішення.100 кг готового колера зі змістом сухих речовин 70% буде містить 70 кг сухих речовин. З урахуванням утрат при варінні необхідно задати сухих речовин 70∙ 1,28=89,6 кг. При вологості цукру 0,15% його знадобиться кг. Води буде потрібно 10% від маси цукру, тобто 89,73∙ 0,1=8,97 кг.
Розрахунок компонентів купажного сиропу Купажні сиропи готують гарячим, напівгарячим і холодним способами. Гарячий і напівгарячий способи застосовують при виготовленні напоїв на натуральних соках і морсах. Холодний спосіб використовують у випадку застосування харчових есенцій, ароматизаторів, композицій і концентратів. Сировина і напівфабрикати закладаються в купажний чан відповідно до рецептури в строго визначеній послідовності. Готовий купажний сироп повинний бути прозорим, мати добре виражений смак, колір і аромат, характерний для напою, що виготовляється. Основні розрахункові формули Цукор вводиться в купаж у виді цукрового сиропу. Його необхідна кількість у л обчислюють по формулі , де SCB — кількість сухих речовин цукру на 100 дал напою по рецептурі, кг; Q — об’єм напою, що підлягає виготовленню, дал; В — вміст цукру в 1 л сиропу. Кількість внесеного в купажний сироп соку визначають з обліком його екстрактивності. Якщо екстрактивність наявного соку вище або нижче рецептурної, варто зробити перерахування норми закладки соку. Спочатку розраховують, скільки сухих речовин вноситься в купажний сироп зі стандартним соком по формулі , де МсСВ — маса екстрактивних речовин стандартного соку, кг; Vр — об’єм соку, внесений по рецептурі, л; b — вміст екстрактивних речовин у соку стандартної якості, г/100 мол. Потім роблять розрахунок об’єм наявного в розпорядженні соку (Vф), екстрактивність якого відрізняється від приведеної в рецептурі: , де bф — фактичний вміст сухих речовин у соку, г/100 мол. Якщо при виготовленні напою сік заміняється екстрактом, то кількість сухих речовин, внесених з екстрактом, повинне дорівнювати кількості сухих речовин, внесених по рецептурі із соком. При розрахунку норми внесення кислоти варто враховувати кислоту, внесену з усіма напівфабрикатами, у тому числі і з інвертним цукровим сиропом. Крім того, необхідно вносити поправку на нейтралізацію лужності води, яка використовується для готування напою. При розрахунках іноді виникає необхідність вираження кислотності напою або напівфабрикату по молочній або іншій кислоті. Це роблять, виходячи з того, що 1 г лимонної кислоти еквівалентний 1,17 г виннокам’яній, 1,4 г молочної кислоти (у перерахуванні на 100%) і 0,5 м ортофосфорної кислоти. Кількість кислоти, внесене в купажний сироп, визначають по формулі , де L0 — маса кислоти, необхідна для одержання кислотності напою, що відповідає рецептурі, кг; А — сумарна маса кислоти, яка внесена в купажний сироп з напівфабрикатами, кг; N — маса кислоти, яка необхідна для нейтралізації лужності води, кг. Для розрахунку маси кислоти, яка необхідна на нейтралізацію лужності води, необхідно визначити об’єм води, що вводиться в напій. Він визначається по різниці об’єм напою й об’єм внесених рідких напівфабрикатів (соку, провина, екстракту, цукрового сиропу). Маса кислоти, необхідної для створення кислотності напою, визначається виходячи з його нормативних фізико-хімічних показників. При розрахунках користуються коефіцієнтом: 1 мл 1н розчину NaOH еквівалентний 0,064 м лимонної, 0,075 м виннокам’яній, 0,09 м молочної і 0,049 м ортофосфорної кислот.
Приклади Приклад 1. Для готування 100 дав напою «Вишня» по рецептурі витрачається 95,53 л вишневого соку з концентрацією сухих речовин 11,4 г/100 мол. Скільки буде потрібно вишневого соку зі вмістом екстрактивних речовин 10,8 г/100 мл для готування 250 дав такого напою? Рішення. Кількість сухих речовин, внесене зі стандартним вишневим соком на 100 дав напою «Вишня» визначимо по формулі : кг. Визначимо фактичний об’єм соку, що потрібно внести на 100 дав напою по формулі : л. Для виготовлення 250 дав напою такого соку буде потрібно 100,83∙ 2,5=252,075 л. Приклад 2. Необхідно виготовити 100 дал напою «Яблуко». Кислотність напою відповідно до рецептури складає 2 мл 1 н розчину NaOH на 100 мл напою. Напій готується з використанням натурального яблучного соку з кислотністю 12,5 мл 1н розчину NaOH. На готування 100 дав напою по рецептурі вноситься 133,7 л соку і 65,7 кг цукру. Лужність води складає 2,5 мг–экв/л. Розрахувати витрати лимонної кислоти. Рішення. 2 мол 0,1 н розчини NaOH на 100 мол готового напою відповідають вмісту лимонної кислоти 2∙ 0,064=0,128 г/100 мол. Т.ч. 100 далготового напою «Яблуко» містять L0=1,28 кг лимонної кислоти. Кислотність використовуваного у виробництві яблучного соку складає 12,5 мол 1 н розчину NaОН на 100 мл. Це відповідає вмісту лимонної кислоти в соку 12,5∙ 0,064=0,8 г/100 м1ол. Т.ч. з яблучним соком буде внесено лимонної кислоти А=8∙ 133,7=1069,6 м або 1,07 кг. Вміст води в напої знаходимо по різниці між об’ємом напою й об’ємами соку і цукру. об’єм розчину цукру визначаємо по формулі , де SCB — витрати сухих речовин цукру на готування напою, кг; с — щільність цукрового розчину (1,56 кг/дм3). Отже, на готування 100 дав напою «Яблуко» витрачається SСВ=65,7∙ 0,9985=65,6 кг сухих речовин, де 0,9985 — вміст сухих речовин у цукрі за ДСТ 21–94, частки. Отже, об’ємг, який займає розчин цукру, буде л. Тоді об’єм води, який необхідний для готування напою, складає л. Кількість лимонної кислоти на нейтралізацію 100 дав води лужністю 2,5 мг–экв/л складе 160 г . Отже, на нейтралізацію обчисленого раніше об’єм води буде потрібно кислоти г. Загальні витрати лимонної кислоти визначаємо по формулі кг. У перерахуванні на товарну лимонну кислоту це складе кг, де 90,97 — вміст сухих речовин у товарній лимонній кислоті за ДСТ 908–79Е, %.
Індивідуальні завдання до практичних занять
Практичне заняття №1. Завдання і задачі 1. Розрахувати витрати компонентів на готування 650 л цукрового сиропу концентрацією 62%. Втрати води при варінні сиропу прийняти 10%. 2. Для варіння цукрового сиропу з концентрацією сухих речовин 65% планується використовувати чистий брак напою зі змістом сухих речовин 6% у кількості 25 л. Скільки цукру і води потрібно задати в сироповарочний казан, якщо об’єм сиропу, що виготовляється, 100 л? 3. Для варіння цукрового сиропу з концентрацією сухих речовин 62,5% застосовують промивні води зі змістом сухих речовин 3,2% у кількості 16 л. Скільки цукру і води потрібно задати в сироповарочний казан якщо об’єм сиропу, що виготовляється, 250 л? 4. Розрахувати витрати компонентів на готування 125 кг колера зі змістом сухих речовин 71,5%. Втрати сухих речовин при варінні колера прийняти 28%. 5. На варіння колера взято 100 кг цукрового піску вологістю 0,15%. Розрахувати вихід готового колера в кг, якщо він складає 105% від кількості сухих речовин цукру. Яка буде концентрація сухих речовин у готовому колере, якщо втрати при варінні складають 28%? 6. Треба приготувати 150 дал напою «Байкал». На 100 дал такого напою по рецептурі вноситься 50,08 кг цукру зі вмістом сухих речовин 99,85 %. Розрахувати об’єм цукрового сиропу концентрацією 67%, що потрібно внести в купажний чан. 7. Витрати апельсинового соку (вміст сухих речовин 9,2 г/100 мл) на готування 100 дал напою «Цитрусовий» складає 285 л. Скільки апельсинового соку зі вмістом сухих речовин 8,5 г/100 мл буде потрібно внести в купаж при виготовленні 50 дал напою? 8. На 100 дал напою «Яблуко» по рецептурі витрачається 133,7 л яблучного соку зі вмістом сухих речовин 9,8 г/100 мл і кислотністю 12,5 мл 1н розчину NaОН на 100 мл соку. Скільки яблучного соку концентрацією 10,5 г/100 мл буде потрібно для виготовлення 120 дав такого напою? Скільки лимонної кислоти буде потрібно внести в купаж, якщо кислотність використовуваного соку складає 12,8 мл 1 н розчину NaОН, а кількість цукру по рецептурі складає 65,7 кг на 100 дав? Кислотність готового напою «Яблуко» — 2 мол 1н розчину NaОН на 100 мл, лужність води, яка використовується у виробництві 1,5 мг–экв/л. 9. Кислотність готового напою «Лимон лайм» складає 2,5 мл 1 н розчину NaОН на 100 мол. Яка кількість лимонної кислоти потрібно внести при виготовленні 150 дал напою, якщо лужність застосовуваної води складає 1 мг–экв/л, а напій виготовляється з застосуванням аспартама й ароматизаторів? 10. Витрати лимонної кислоти на виготовлення 100 дал напою «Кола» складає 0,4 кг. Яка кількість ортофосфорної кислоти буде потрібно внести при виготовленні 185 дал напою, якщо лужність використовуваної води 0,5 мг-экв/л? Витрати цукру на готування 100 дав напою дорівнює 50,08 кг.
Методичні рекомендації до лабораторних робіт з курсу «Сучасні біотехнологічні методи та виробництва
Тема . ПОЛІСАХАРИДИ. КРОХМАЛЬ ТА КЛІТКОВИНА Крохмаль. Крохмаль - головна речовина, що міститься у зерні злаків. Від представляє собою полімер, який складається із залишків а-В-глюкози. У зерні крохмаль знаходиться у вигляді крохмальних зерен різного розміру та форми. Крохмаль дає дуже характерну реакцію з розчином йоду - забарвлюється у синій колір. Ця реакція застосовується для виявлення та кількісного визначення крохмалю. Крохмальні зерна при нагріванні у воді утворюють крохмальний клейстер. Клейстеризація крохмалю різного походження наступає при різній температурі. Пшеничний крохмаль клейстеризуєтьея при 62,5 °С, житяний — при дещо меншій температурі. Крохмаль складається з амілози та амілопектину. Ці речовини сильно розрізняються за своїми фізичними та хімічними властивостями. Так, наприклад, від йоду амілоза забарвлюється у синій колір, а амілопектин — у червоно-фіолетовий. Вони розрізняються також за розчинністю: амілоза легко розчинюється у теплій воді та дає розчини з відносно невисокою в'язкістю, у той час, як амілопектин розчинюється у воді лише при нагріванні та під високим тиском та дає дуже в'язкі розчини. Амілоза та амілопектин відрізняються за своєю хімічною будовою. У молекулі амілози окремі залишки глюкози зв'язані між собою у вигляді нерозгалуженої нитки. Молекулярна маса амілози коливається від 3•105 до 1•106. Якщо амілоза представляє собою лінійний полімер, то молекула амілопектину є дуже розгалуженою. Молекулярна маса амілопектину сягає сотень мільйонів. Різноманітні методи визначення вмісту крохмалю засновані на його розщепленні та урахуванні проміжних або кінцевих продуктів гідролізу, що утворилися. Одним з найбільш швидких, хоча й менш точних методів визначення вмісту крохмалю, є метод Еверса. Визначення вмісту крохмалю за методом Еверса засновано на здатності фракцій крохмалю, отриманих у процесі гідролізу, обертати площину поляризованого променя. Величина куту оберту для однієї й тієї ж речовини пропорційна його концентрації у розчині.
Лабораторна робота № 1. Визначення вмісту крохмалю. Матеріал: борошно, розмолоте зерно. Реактиви: розчин соляної кислоти ω (НС1) = 1,124%; розчин гексацианоферату калію ω (К4[Fе(СМ)6]) = 15%. Хід роботи У мірну колбу на 100 мл вносять 5 г тонкоподрібненого зерна, приливають 25 мл розчину соляної кислоти, ретельно збовтують, щоб не залишалися грудочки, знов приливають 25 мл тієї ж кислоти, змиваючи частинки борошна, що пристали до горла колби, усе збовтують та нагрівають колбу 15 хв. у киплячій водяній лазні. Після гідролізу крохмалю у колбу приливають 30 мл холодної води, вміст колби охолоджують до 20 °С та для осадження білка приливають 10 мл розчину жовтої кров'яної солі з масовою долею ω (К4[Fе(СМ)6])= 15%. Вміст колби доводять дистильованою водою до мітки та фільтрують через сухий складчастий фільтр у суху колбу. Повністю прозорий фільтрат наливають у поляризаційну трубку так, щоби у ній не залишилося пухирців повітря, потім трубку переносять у поляриметр та визначають кут обертання. Вміст крохмалю визначають за формулою:
де X - вміст крохмалю, %; а - кут обертання у градусах; Р - наважка борошна; 1 - довжина поляризаційної трубки, дм; W - вологість досліджуваної речовини, %; а 20D - питоме обертання декстринів, + 182,8°; 0,3469 - величина переводного коефіцієнту з круглої шкали поляриметру на нормальну шкалу цукрометру (одне ділення нормальної шкали дорівнює 0,3469 градуси). Для кожної оптично активної речовини характерною константою є її питоме обертання. Питомим обертанням називається кут обертання, який має розчин, що містить у 100 мл 100 г речовини при довжині трубки 1 дм. Його виражають через а 20D , де 20 означає температуру розчину, а D - лінію спектру (натрієве полум'я). Питоме обертання фракцій, отриманих з крохмалю різних культур, у градусах: картоплі - 194,5 рису - 183,9 жита - 184,0 пшениці - 182,0 ячменя - 181,5 вівсу - 181,3
Клітковина Клітковина (целюлоза) представляє собою найбільш широко розповсюджений полісахарид рослин, який складається із залишків а-В-глюкози та утворює головну складову частину клітинних стінок. Основні джерела клітковини - волокно бавовнику, волокнисті рослини (льон, конопля). солома, деревина. У рослин клітковина тісно зв'язана з геміцелюлозою, пектиновими речовинами, смолами, ліпідами. Клітковина нерозчинна у воді, органічних розчинниках, а також у розведених кислотах та лугах.
Лабораторна робота № 2. Визначення вмісту клітковини. Дослід 1. Визначення клітковини за Кюршнером та Ганеком. Матеріал: насіння рослин. Реактиви:суміші (за об'ємом 1:10) - а) концентрована азотна кислота НNО3, (р =1,44 г/мл) + розчин оцтової кислоти ώ (СН3СООН) = 80%; б) діетиловий ефір + етиловий спирт. Хід роботиНаважку масою близько 1 г великоподрібненого насіння поміщають у колбу на 150 мл, приливають 40 мл суміші кислот; закривши колбу нагрівають її на піщаній лазні протягом 40 хв. Одержаний білий осад відфільтровують через поперіедньо зважений фільтр. Осад промивають невеликими порціями дистюіьованої води, а потім 100 мл суміші спирту з ефіром. Одержаний осад (клітковину) висушують на фільтрі до постійної ваги при температурі 105 °С. Процентний вміст клітковини розраховують за формулою: X= (B1 – B)·100/ H
де X - вміст клітковини, %; В1 - вага фільтру з сухим залишком, г; В - вага фільтру без осаду, г; Н - наважка, г.
Дослід 2. Визначення вмісту клітковини за методом Генеберга та Штомана Матеріал: насіння рослин, висівки. Реактиви: розчин сірчаної кислоти ώ(Н28О4) - 5%; розчин їдкого калі ώ (КОН) = 5%; розчин фенолфталеїну. Хід роботи2 г досліджуваного матеріалу висипають у склянку ємністю 400 мл, на котрому ставлять мітки по 50 мл (усього 200 мл). Наважку заливають водою до 50 мл, додають 50 мл сірчаної кислоти та води до 200 мл. По мірі википання сірчаної кислоти до склянки доливають дистильовану воду, щоб загальний об'єм рідини залишався на рівні 200 мл. Потім рідину охолоджують та відсмоктують через матерчатий фільтр за допомогою вакуумного (водоструминного) насосу до 50 мл. Прилітають дистильовану воду до 150 мл та додають 50 мл їдкого калі. Знов кип'ягять на плитці протягом ЗО хв., після чого заливають холодною дистильованою водою доверху. Потім рідину відсмоктують до 50 мл, а залишок заливають гарячою водою до 150 мл. Оброблений таким чином продукт фільтрують через попередньо висушений та зважений фільтр. Осад на фільтрі промивають гарячою водою до нейтрального середовища (за фенолфталеїном) і висушують у термостаті при 105 °С до постійної маси (3-4 год.). Розрахунок вмісту клітковини проводять за формулою: X = (a-b) ·100·100/ m·(100-W) ' де X — вміст клітковини, %; а — маса фільтру з осадом, г; b - маса фільтру без осаду, г; m — маса наважки матеріалу, г; W — вологість матеріалу, %.
Індивідуальні завдання до лабораторних робіт № 1, 2.
1 . Які речовини називають полісахаридами? 2. Які полісахариди ви знаєте? 3. Які функції виконують полісахариди у живій клітині, зокрема, рослинній? 4. Що являє собою крохмаль? 5. Різновидності крохмалю: як вони утворюються, яка їх фізіологічна роль? 6. Якими властивостями володіє крохмаль? 7. У чому полягає різниця між амілозою та амілопектином? 8. Які ферменти приймають участь у гідролізі крохмалю, які при цьому утворюються продукти? 9. Чим відрізняються α-амілаза та β-амілаза? 10. У чому різниця між ферментативним та кислотним гідролізом? 1 1 . На чому заснований метод визначення вмісту крохмалю за Еверсом? 12. Що представляють собою пентозани? Яка їх фізіологічна роль? 13. Які сполуки відносяться до пектинових речовин? Де вони використовуються? 14. Що представляють собою слизі (гумі)? Як впливають вони на формування та властивості клейковини (наприклад, житньої)? 15. Що називають клітковиною? Який її склад? 16. Яка фізіологічна роль клітковини? 17. Чим відрізняється целюлоза від крохмалю? 18. Що таке геміцелюлоза та який її склад?
Перелік навчальної лiтератури
КомментарииКомментариев пока нет Пожалуйста, авторизуйтесь, чтобы оставить комментарий. |